Como tornar uma linha celular transfectada estável

Certifique-se de que apenas uma célula está presente por poço após a transferência.

1. Etapa 1: Transfectar células. Transfectar as células usando o método de transfecção desejado. ...
2. Etapa 2: células de passagem com antibiótico. ...
3. Etapa 3: monitorar células "ilhas" ...
4. Etapa 4: isole as colônias. ...
5. Etapa 5: transferir células individuais.

1. Como você torna uma linha celular estável?
2. Como você escolhe colônias para linhas de células estáveis?
3. O que são linhas celulares estáveis?
4. Como você cria uma linha celular?
5. Onde são encontradas células estáveis?
6. Como você seleciona uma célula transfectada?
7. Qual é o significado das linhas celulares?
8. Qual é a diferença entre transfecção estável e transitória?
9. Como você usa um cilindro clone?
10. O que é expressão de gene estável?
11. Células estáveis ​​podem se regenerar?
12. O que é uma célula permanente?

Como você torna uma linha celular estável?

O protocolo para gerar linhas celulares estáveis ​​requer várias etapas, conforme mostrado abaixo:

1. Gere uma curva de morte para determinar a concentração de antibiótico de seleção ideal.
2. Transfectar células com construto (s) de plasmídeo desejado
3. Selecione e expanda colônias policlonais estáveis.
4. Identificar clones únicos por diluição e expansão limitadas.

Como você escolhe colônias para linhas de células estáveis?

Para escolher as colônias, prepare pratos de 24 poços com 1 ml de mídia contendo G418 em cada poço. Enxágüe o prato com PBS e, em seguida, adicione PBS quente contendo 5% de tripsina (1 ml de tripsina-EDTA padrão mais 19 ml de PBS).

O que são linhas celulares estáveis?

A geração de uma linha celular estável refere-se ao processo de desenvolvimento de populações homogêneas de células que demonstram a expressão de uma inserção de gene transfectada. ... Isso é o oposto de células transfectadas transientes que expressam o DNA transfectado por um curto período de tempo (por exemplo, 8 a 96 horas).

Como você cria uma linha celular?

A maneira mais simples de criar uma nova linha celular é modificar uma já existente, estratégia comum quando uma linha estabelecida já chega perto de atender aos requisitos. As células otimizadas para cultivar vírus específicos ou maximizar a produção de proteína recombinante, muitas vezes vêm de tais modificações.

Onde são encontradas células estáveis?

Na biologia celular, as células estáveis ​​são células que se multiplicam apenas quando necessário. Eles passam a maior parte do tempo no quiescente G₀ fase do ciclo celular, mas pode ser estimulado a entrar no ciclo celular quando necessário. Os exemplos incluem o fígado, os túbulos proximais do rim e as glândulas endócrinas.

Como você seleciona uma célula transfectada?

Uma das maneiras mais confiáveis ​​de selecionar células que expressam de forma estável o DNA transfectado é incluir um marcador selecionável no construto de DNA usado para transfecção ou em um vetor separado que é co-transfectado na célula e, em seguida, aplicar a pressão seletiva apropriada ao células após um curto período de recuperação.

Qual é o significado das linhas celulares?

Linhagem celular é um termo geral que se aplica a uma população definida de células que podem ser mantidas em cultura por um longo período de tempo, retendo a estabilidade de certos fenótipos e funções. As linhas celulares são geralmente clonais, o que significa que toda a população se originou de uma única célula ancestral comum.

Qual é a diferença entre transfecção estável e transitória?

Na transfecção estável, o DNA do plasmídeo se integra com sucesso ao genoma celular e será transmitido às gerações futuras da célula. No entanto, na transfecção transitória, o material transfectado entra na célula, mas não se integra ao genoma celular.

Como você usa um cilindro clone?

Usando uma pinça média estéril, pegue um cilindro de clonagem. Pressione suavemente a parte inferior plana do cilindro na graxa de silicone lisa e remova com um movimento vertical repentino. Se feito corretamente, isso proporcionará uma distribuição uniforme da graxa na parte inferior do cilindro. Coloque o cilindro sobre uma colônia.

O que é expressão de gene estável?

A expressão do código genético estrangeiro é contínua e o procedimento de transfecção é denominado transfecção estável. Se a célula hospedeira rejeitar o segmento de DNA inserido, a transfecção se torna transitória porque a expressão do material genético introduzido é perdida com as gerações subsequentes.

Células estáveis ​​podem se regenerar?

As células lábeis (1), como o epitélio escamoso da pele, se dividem e se regeneram continuamente. As células permanentes (2), como os neurônios, são incapazes de proliferar e deixar o ciclo celular. As células estáveis ​​(3), como os hepatócitos do fígado, têm um baixo nível de replicação e podem se regenerar quando sinalizadas.

O que é uma célula permanente?

As células permanentes são definidas como células incapazes de se replicar na vida pós-natal. As células nervosas, também denominadas neurônios, juntamente com o músculo esquelético e as células cardíacas, estão incluídas neste grupo, que tradicionalmente identifica os tecidos humanos que são incapazes de regeneração espontânea.