desafios na extração de rna

Guia de solução de problemas para extração total de RNA & Purificação

1. O que causa a degradação do RNA?
2. Como a extração de RNA pode ser melhorada?
3. Por que o RNA é mais difícil de extrair do que o DNA?
4. Como você pode prevenir a contaminação de DNA durante o isolamento de RNA?
5. Como podemos proteger o RNA da degradação?
6. A autoclavagem destrói o RNA?
7. Como você congela células para extração de RNA?
8. Como você se livra do RNA?
9. Como funciona a extração de RNA?
10. Por que o nitrogênio líquido é usado na extração de RNA?
11. Qual é o propósito da extração de RNA?
12. O que é um bom rendimento de RNA?

O que causa a degradação do RNA?

Existem duas razões principais para a degradação do RNA durante a análise do RNA. Primeiro, o RNA, por sua própria estrutura, é inerentemente mais fraco do que o DNA. ... Isso torna o RNA mais quimicamente lábil do que o DNA. O RNA também é mais sujeito à degradação pelo calor do que o DNA.

Como a extração de RNA pode ser melhorada?

Existem 3 métodos eficazes para fazer isso:

1. Homogeneizar completamente as amostras imediatamente após a colheita em uma solução de lise celular de base caotrópica (por exemplo, contendo guanidínio) como o tampão de lise disponível no PureLink RNA Mini Kit ou TRIzol Reagent.
2. Amostras de congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.

Por que o RNA é mais difícil de extrair do que o DNA?

A principal razão é que o RNA é menos estável e mais fácil de degradar em comparação com o DNA. ... O RNA tem sulcos maiores do que o DNA, o que torna mais fácil ser atacado por enzimas. As enzimas que degradam o RNA, ribonucleases (RNases) são abundantes no ambiente e difíceis de serem removidas completamente.

Como você pode prevenir a contaminação de DNA durante o isolamento de RNA?

O problema às vezes pode ser evitado restringindo os primers para ultrapassar os limites do íntron, mas isso é frequentemente difícil e os métodos atualmente usados ​​para reduzir a contaminação do DNA incluem digestão com DNAse I, fracionamento em gel, fenol ácido: extração com clorofórmio e precipitação com cloreto de lítio.

Como podemos proteger o RNA da degradação?

A fim de evitar a degradação, as amostras de RNA são geralmente armazenadas congeladas a −20 ° C ou −80 ° C ou sob nitrogênio líquido.

A autoclavagem destrói o RNA?

Certifique-se de separar os reagentes usados ​​para o trabalho de RNA dos "reagentes de uso geral" no laboratório. Todas as soluções, exceto os tampões Tris, devem ser tratadas com 0,1% DEPC (ou DMPC) durante a noite em temperatura ambiente e então autoclavadas. A autoclavagem hidrolisa e destrói DEPC e DMPC que não reagiram.

Como você congela células para extração de RNA?

Coloque o tecido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml ou cônico de 15 ml e congele em gelo seco. Alternativamente, embrulhe o lenço em papel alumínio e congele com nitrogênio líquido.

Como você se livra do RNA?

A contaminação de RNA pode ser removida pela adição de 2 microlitros de RNase A (10 mg / ml, Fermentas) a 20 microlitros de DNA dissolvido em tampão TE (Tris-EDTA, pH = 8,0) e incubar por 3-4 h a 37 ° C.

Como funciona a extração de RNA?

Métodos de extração orgânica

Durante a centrifugação, a amostra se separa em três fases: uma fase orgânica inferior, uma fase intermediária que contém proteínas desnaturadas e gDNA e uma fase aquosa superior que contém RNA. A fase aquosa superior é recuperada e o RNA é coletado por precipitação e reidratação com álcool.

Por que o nitrogênio líquido é usado na extração de RNA?

O nitrogênio líquido é usado porque tem uma temperatura muito baixa de -176 ° C que ajuda a pulverizar a substância dura do tecido vegetal e animal para se transformar em pó. Também ajuda na desativação da DNAase para digerir o DNA .

Qual é o propósito da extração de RNA?

A extração de RNA é a purificação do RNA de amostras biológicas. Este procedimento é complicado pela presença onipresente de enzimas ribonuclease em células e tecidos, que podem degradar rapidamente o RNA.

O que é um bom rendimento de RNA?

Um A₂₆₀/UMA₂₈₀ razão maior que 1,8 é geralmente considerada um indicador aceitável de RNA de boa qualidade com um baixo nível de contaminação por proteína [14, 15]. Um A₂₆₀/UMA₂₃₀ razão superior a 1,8 é usada como um indicador de RNA extraído com um baixo nível de contaminação de polissacarídeos.