protocolo de cultura de células de tripsina edta

Procedimento

1. Remova o meio do recipiente de cultura por aspiração e lave a monocamada com uma solução de sal livre de Ca²⁺ e Mg²⁺ para remover todos os vestígios de soro. ...
2. Dispensar tripsina ou solução de tripsina / EDTA suficiente no (s) recipiente (s) de cultura para cobrir completamente a monocamada de células e colocar na incubadora a 37 ° C por ~ 2 minutos.

1. Como você prepara a solução de tripsina EDTA para cultura de células?
2. Por que a tripsina EDTA é usada em cultura de células?
3. Como é feita a subcultura de células aderentes usando tripsina EDTA e EDTA sozinho?
4. Como você descongela tripsina EDTA?
5. A tripsina pode matar células?
6. O que podemos adicionar à cultura para inibir a tripsina?
7. O EDTA pode matar células?
8. Por que o soro inibe a tripsina?
9. O EDTA é tóxico para as células?
10. Por que usamos tripsina?
11. Por que você lava células com PBS?
12. Por que você lava as células com PBS antes de adicionar tripsina?

Como você prepara a solução de tripsina EDTA para cultura de células?

Adicione 12 a 15 mL de meio de cultura de células fresco a um novo frasco e equilibre este meio para o pH e temperatura apropriados. Colete a suspensão de células, conte e / ou divida e dispense as células no frasco recém-preparado. Consulte a folha de produto da linha celular para as taxas de subcultivo recomendadas.

Por que a tripsina EDTA é usada em cultura de células?

O EDTA atua como um quelante de metal, que é adicionado às soluções de tripsina para aumentar a atividade. O EDTA é adicionado para remover o cálcio e o magnésio da superfície celular, o que permite à tripsina hidrolisar ligações peptídicas específicas. A principal razão do uso do EDTA junto com a tripsina é para remover a adesão de célula a célula.

Como é feita a subcultura de células aderentes usando tripsina EDTA e EDTA sozinho?

Pipete tripsina / EDTA para a monocamada de células lavadas usando aproximadamente 1ml por 25cm2 de área de superfície. Gire o frasco para cobrir a monocamada com tripsina. Decante o excesso de tripsina. Retorne o frasco para a incubadora e deixe por 2-10 minutos.

Como você descongela tripsina EDTA?

Remova a solução de tripsina / EDTA do armazenamento e coloque-a durante a noite a 2 ° C a 8 ° C. 2. Transfira a garrafa para um banho-maria a 37 ° C e agite suavemente a garrafa para misturar quaisquer solutos. Não mantenha a solução de tripsina / EDTA a 37 ° C por mais tempo do que o necessário.

A tripsina pode matar células?

A incubação de células com uma concentração muito alta de tripsina por um período de tempo muito longo danificará as membranas celulares e matará as células.

O que podemos adicionar à cultura para inibir a tripsina?

A tripsina é inibida pelo soro que fornece os cátions divalentes como cálcio e magnésio, que desempenham um papel no processo de sinalização intra e intercelular, ou seja, formando CAMs, portanto, o soro é geralmente adicionado ao recipiente assim que as células se destacam - isso pode ser confirmado por observação sob microscópio.

O EDTA pode matar células?

uma. Use 5 mM EDTA ou superior NOTA: muito EDTA pode matar suas células b. Accutase e Accumax são produtos de dissociação de células vendidos pela Innovative Technologies que podem ajudar na manutenção de suspensões de células únicas.

Por que o soro inibe a tripsina?

Olá, Tripsina é uma endopeptidase, que digere proteínas. No processo de tripsinização, proteínas extracelulares são digeridas, o que leva ao desprendimento das células do fundo do recipiente de cultura. ... O soro contém muitos inibidores da protease, que interrompem a tripsina, principalmente alfa-1-antitripsina. Espero que isto ajude!

O EDTA é tóxico para as células?

Nenhuma toxicidade foi observada quando as células foram expostas a 100 microM de Zn- ou Fe-EDTA, mas a mesma concentração de Cu-EDTA foi tão tóxica quanto Na-EDTA. A exposição contínua das culturas de células a 5 microM de Na- ou Zn-EDTA por até 7 semanas não produziu indicações de toxicidade.

Por que usamos tripsina?

A tripsina é uma enzima que nos ajuda a digerir proteínas. No intestino delgado, a tripsina quebra as proteínas, continuando o processo de digestão que começou no estômago. Também pode ser referido como uma enzima proteolítica ou proteinase. A tripsina é produzida pelo pâncreas em uma forma inativa chamada tripsinogênio.

Por que você lava células com PBS?

Na cultura de células durante o derramamento, a lavagem com PBS é necessária para remover o soro da mídia, de modo que a tripsina seja capaz de separar as células da placa, de outra forma o soro pode inativar a tripsina.

Por que você lava as células com PBS antes de adicionar tripsina?

Antes de adicioná-lo às células, você precisa lavar o meio de cultura celular, uma vez que a tripsina também quebra as proteínas que estão presentes na mídia, como o FCS, reduzindo sua atividade antes de atingir as células.